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技术资讯
Technical Information王继凤1 李芙燕1 陈耀星1 3 王子旭1 呙于明2
(1. 中国农业大学动物医学院,北京100193 ; 2. 中国农业大学动物科技学院,北京100193)
摘 要: 本试验通过日粮中添加丁酸钠研究其对肉鸡小肠黏膜免疫相关细胞的影响。将32 只1 日龄健康AA 肉鸡随机分为4 个处理组:A 组(对照组:基础日粮) 、B 组(丁酸钠组:基础日粮+ 500 mg/ kg 丁酸钠) 、C 组(丁酸钠+ 芽孢杆菌组:基础日粮+ 100 mg/ kg 丁酸钠+ 200 mg/ kg 芽孢杆菌) 和D 组(丁酸钠+ 酶制剂组:基础日粮+ 100 mg/ kg丁酸钠+ 500 mg/ kg 酶制剂) 。试验7 周后,采用组织学技术研究肉鸡小肠黏膜免疫相关细胞的分布变化。结果显示: (1) 与对照组比较,小肠肥大细胞、上皮内淋巴细胞及杯状细胞的形态无明显变化,肥大细胞多存在于肠腺周围和肠绒毛固有层; (2) 各试验组的小肠肥大细胞、上皮内淋巴细胞及杯状细胞数均显著高于对照组( P < 0.05) ; (3)各试验组和对照组小肠肥大细胞和上皮内淋巴细胞数均从前向后逐渐减少,十二指肠的肥大细胞最多,空肠的次之,回肠的较少;杯状细胞数则与之相反。由此可知,3 种添加剂可不同程度地改善肉鸡小肠黏膜结构,且将丁酸钠分别与芽孢杆菌和酶制剂混合饲喂,效果在一定程度上好于单独饲喂丁酸钠。
关键词: 丁酸钠;黏膜免疫相关细胞;小肠;肉鸡
短链脂肪酸(s hort chai n f at t y acid ,SCFA) 是由大肠内厌氧菌通过发酵可溶性纤维产生的碳链为1～6 的有机酸。在短链脂肪酸中乙酸、丙酸和丁酸对人体代谢有重要作用。其中丁酸有水、脂两亲性,偏重于亲脂。在p H 4～6 时不易被分解,所以部分可以避过酸性环境的小肠, 直接进入盲肠和结肠。由于丁酸具有游离性和挥发性的特点,所以在生产中一般将其制成相对稳定的钠盐。在20 世纪80 年代初期国外学者就已经观察到短链脂肪酸钠盐影响瘤胃营养代谢及其消化能力。丁酸钠作为一种新型饲料添加剂, 对动物的生长有一定的促进作用,同时还可以为结肠提供能量物质。另外在畜禽日粮中添加酸化剂丁酸钠也可以促进动物生长、提高饲料转化率、改善动物肠道内微生物区系以及调整动物肠道菌群的生态平衡,提高其机体免疫力。但对于丁酸钠作为一种新型饲料添加剂的研究主要集中于对动物生长和生产的影响, 而对小肠形态结构影响的研究比较薄弱。为此,本试验拟通过研究丁酸钠及其与其他类饲料添加剂配伍后对肉鸡小肠形态结构的影响, 为科学使用这种饲料添加剂提供形态学依据。
1、材料与方法
1. 1 试验动物的分组与饲养
将32 只1 日龄健康AA 肉鸡随机分成4 个处理组,每组8 只:A 组(对照组:基础日粮) 、B 组(丁酸钠组:基础日粮+ 500 mg/ kg 丁酸钠) 、C 组(丁酸钠+ 芽孢杆菌组:基础日粮+ 100 mg/ kg 丁酸钠+ 200 mg/ kg芽孢杆菌) 和D 组(丁酸钠+ 酶制剂组:基础日粮+100 mg/ kg 丁酸钠+ 500 mg/ kg 酶制剂) 。开放式鸡舍单笼饲养,各组其他饲养管理方法完全一致,即按北京爱拔益加家禽育种有限公司提供的《肉用仔鸡饲养管理手册》进行饲养管理,饲养期为7 周。
1. 2 取材
将肉鸡放血处死, 剖开腹腔, 迅速取出十二指肠、空肠和回肠各5 cm 左右,用新配制的生理盐水洗干净,放入4 %多聚甲醛磷酸缓冲液(011 mol/ L ,p H 7.4) 中固定48 h 。
1. 3 染色与数据处理
1. 3. 1 甲苯胺兰染色
石蜡包埋,连续横断切片, 厚6 μm 。在染色液(0.8 %甲苯胺兰,0.6 %高锰酸钾,蒸馏水煮沸配制)中浸染约30 s , 蒸馏水洗2 次后, 用90 %酒精分色(显微镜下控制) ,100 %酒精脱水,二甲苯透明,中性
树脂封片。光镜下观察肥大细胞的形态及其分布,统计各段小肠横断面全层肥大细胞的数量。SAS8.2 软件包(SAS Institute , 2001) 对统计的数据进行单因素方差分析。
1. 3 . 2 HE 染色和PAS 染色
石蜡包埋, 连续横断切片, 厚6 μm , 进行常规HE 染色和PAS 染色。光镜下详细观察上皮内淋巴细胞和杯状细胞的形态及其分布, 在各段小肠每一横切面中选取5 根柱状细胞排列整齐的肠绒毛,统计每100 个柱状细胞中散在分布的上皮内淋巴细胞和杯状细胞数量。应用SAS 8. 2 软件包(SAS Institute , 2001) 对数据进行单因素方差分析。
2、结果
2. 1 各处理组小肠肥大细胞、上皮内淋巴细胞和杯状细胞分布与形态
2. 1 . 1 小肠肥大细胞
由图1 可知,经甲苯胺蓝染色后,肥大细胞呈紫红色; 形状多样,有圆形、椭圆形或梭形,大小不一。胞浆内颗粒丰满, 部分细胞呈脱颗粒状。各试验组肥大细胞的形态未见明显差异。各试验组小肠的肥大细胞多存在于肠腺周围。小肠绒毛也有肥大细胞分布,但多位于固有层中,且按小肠绒毛底部、中部、顶部依次减少。少量肥大细胞分布于肌层和浆膜层,常见于小血管和小淋巴管周围。
2. 1. 2 上皮内淋巴细胞和杯状细胞
由图1 可知,经HE 染色后在光镜下观察,可见上皮内淋巴细胞散在分布于肠绒毛上皮细胞之间,多数位于上皮细胞基侧膜附近。少量见于上皮核层和顶层。该细胞以小型细胞为主, 胞核大而圆, 深染,胞浆较少。杯状细胞经PAS 染色后呈红色, 高脚杯状,散在分布于上皮细胞间,不同的肠段杯状细胞的数量也有所不同。
2. 2 小肠肥大细胞、上皮内淋巴细胞和杯状细胞数量
2. 2 . 1 小肠肥大细胞
由表1 可以看出,各试验组肥大细胞的数量存在差异,且均高于对照组( P < 0.05) 。在十二指肠,D 组的肥大细胞最多, 其次是C 组, 但2 组间差异不显著( P > 0.05) ,B 组的肥大细胞数量少于C 组,但多于A 组, 并且3 组之间存在显著差异( P <0.05) ;空肠D 组的肥大细胞最多,其次分别是C 、B组,D 组与C 、B 组间存在显著差异( P < 0.05) ,但C和B 组间无显著性差异( P > 0.05) 。回肠的肥大细胞C 组最多,其次是B 和D 组,而C、B 和D 组之间无显著性的差异,但C、B 和D 组与对照组间存在显著性差异( P < 0.05) 。各处理组的肥大细胞数从十二指肠到回肠逐渐减少。
2. 2 . 2 上皮内淋巴细胞
表2 为各处理组小肠上皮内淋巴细胞数量的变化。在十二指肠中C 组的上皮内淋巴细胞数最多,D 组次之, 2 组间无显著性差异( P > 0.05) ,B 组的上皮内淋巴细胞数量显著少于D 组( P < 0.05) ,各试验组的上皮内淋巴细胞数量都显著多于对照组( P < 0.05) ;空肠的上皮内淋巴细胞数量以D 组最多,其次是C 组, 2 组间存在显著性差异( P <0.05) ,B 组的上皮内淋巴细胞数量显著少于C 组( P < 0.05) ,3 个试验组上皮内淋巴细胞数量显著多于对照组( P < 0.05) ; 回肠以D 组上皮内淋巴细胞数量最多,其次是B 组, 2 组间无显著性差异( P >0.05) ,C 组上皮内淋巴细胞数量显著少于D 组( P < 0.05) , 各试验组上皮内淋巴细胞数显著多于对照组( P < 0.05) 。各试验组的上皮内淋巴细胞数从十二指肠到回肠递减。
2. 2 . 3 上皮内杯状细胞
表3 可以看出各处理组对上皮内杯状细胞数量的影响。在十二指肠中D 组的杯状细胞数最多,其次是C 组,2 组间存在显著性差异( P < 0.05) , C 组的杯状细胞数量显著多于B 组( P < 0.05) , 各试验组的杯状细胞数量都显著多于对照组( P < 0.05) ;在空肠中D 组的杯状细胞数最多,B 组次之,2 组间存在显著性差异( P < 0.05) , C 组的杯状细胞数显著少于B 组( P < 0.05) , 3 个试验组的杯状细胞数量除C 组外都显著多于对照组( P < 0.05) ; 回肠的杯状细胞数量也是以D 组的最多,C 组较少,2 组间存在显著性差异( P < 0.05) ,B 组的杯状细胞显著少于C 组( P < 0.05) ,各试验组的杯状细胞都显著多于对照组( P < 0.05) 。表3 反映出各组小肠上皮内杯状细胞数量由十二指肠到回肠逐渐增加。
3、讨论
3. 1 3 种饲料添加剂对肉鸡小肠肥大细胞数量分布的影响
肠道不仅是消化、吸收营养物质的场所,而且具有重要的免疫功能。由于在肠道内多种微生物形成菌丛,而肠道允许这些微生物共存的同时,可以识别侵入的有害微生物以及被黏膜上皮吸收的异己物质,并加以排除,因而肠道黏膜免疫是机体防止感染的第一道防线。肠道黏膜屏障包括机械屏障和免疫学屏障等,主要由肠黏膜吸收上皮细胞和肠道相关淋巴细胞构成。肠黏膜吸收上皮细胞除了具有营养物质消化吸收功能外, 在调节机体天然和获得性免疫中也具有重要的作用。肠道相关淋巴细胞包括肥大细胞、淋巴细胞、杯状细胞等,其中肥大细胞是天然免疫的效应细胞之一, 不仅在天然免疫中发挥重要作用,是机体抗感染免疫的第一线细胞,而且能通过所分泌的细胞因子参与获得性免疫,所以肥大细胞是重要的免疫活性细胞。有报道指出肠道中的肥大细胞对肠道疾病有一定的防御作用, 肠道黏膜上皮首先对入侵的细菌发生反应, 从而激活邻近的肥大细胞产生放大效应。本试验在饲料中加入不同的添加剂后,发现不同程度地促进肉鸡小肠肥大细胞的数量增加, 而丁酸钠和酶制剂组肥大细胞的数量增加最多, 作用略强于丁酸钠和芽孢杆菌组, 但这两组增加的肥大细胞数量都多于丁酸钠组, 这说明将丁酸钠分别与芽孢杆菌和酶制剂混合使用, 能更好的维护机体的免疫功能,防止机体受到病原菌的侵害,从而有利于机体的生长。试验结果表明各处理组的肥大细胞从十二指肠到回肠递减, 有试验表明在小鼠消化道中空肠的肥大细胞数量也多于回肠的肥大细胞数量,与本研究结果类似。但是, 肥大细胞这种分布特点的生理意义还有待于进一步研究。
3. 2 3 种饲料添加剂对肉鸡小肠上皮内淋巴细胞数量分布的影响
肠道相关淋巴组织分为组织性淋巴样组织及散在于整个肠壁中的淋巴细胞。上皮内淋巴细胞是黏膜免疫系统中最先接触抗原的免疫活性细胞, 在肠道黏膜中起重要的免疫屏障作用。本试验的结果表明将丁酸钠和酶制剂混合加入饲料中会使上皮内淋巴细胞的数量明显的增多, 而且效果好于丁酸钠和芽孢杆菌的混合作用, 但是这两组间在空肠和回肠中的作用有一定的差异, 这可能是因为酶制剂主要在空肠和回肠发挥作用。本研究结果表明各组上皮内淋巴细胞从十二指肠到回肠逐渐减少, 这一分布特点和已有的报道一致 。
3. 3 3 种饲料添加剂对肉鸡小肠上皮内杯状细胞数量分布的影响
在吸收细胞中还夹杂有杯状细胞, 杯状细胞的主要功能是分泌黏蛋白,黏蛋白是一种糖蛋白,释入管腔内成为润滑性黏液涂布于上皮表面, 对上皮具有保护作用。杯状细胞分泌的黏蛋白和柱细胞分泌的复合糖蛋白组成了肠道黏膜上皮细胞表面的细胞衣,而且细胞衣的糖蛋白和细胞膜的蛋白质和脂质结合牢固,可捕获微生物,是潜在致病原的重要物理屏障。在本试验中发现在饲料中添加丁酸钠和酶制剂会使上皮内杯状细胞的数量显著增多, 而且效果要好于丁酸钠和芽孢杆菌的混合使用, 但是将丁酸钠分别与酶制剂和芽孢杆菌混合使用,效果都好于单独使用丁酸钠。试验结果表明各处理组的杯状细胞由十二指肠到回肠逐渐递增, 细胞衣增厚,可以更好发挥其潜在的物理屏障, 从而避免机体受到外界病原微生物的侵害。这表明这几种添加剂提高了机体的免疫能力, 有利于机体的生长。Clausen 等研究表明肠道内丁酸盐浓度降低是结肠息肉和结肠癌发病率高的原因之一。也有研究表明丁酸钠可以减缓结肠癌细胞的生长和分化。这些研究说明丁酸钠对动物免疫水平具有一定的作用, 而本研究中的数据表明在饲料中添加丁酸钠可以显著增加肥大细胞、上皮内淋巴细胞和杯状细胞的数量, 这也说明丁酸钠可以提高动物的肠黏膜免疫功能, 增强黏膜的屏障功能。有研究表明芽孢杆菌是一种益生素,它能在数量上补充肠道内缺乏的正常微生物,调整、维持体内生态平衡,从而增强动物机体的免疫功能,提高饲料转化率,达到防病治病,提高畜禽生产性能的目的。酶制剂则含有多种消化酶, 能有效促进各种营养物质的消化和吸收, 减少营养过剩性腹泻的发生。这与本试验的结果一致。
4、结论
通过本试验在饲料中添加500 mg/ kg 的丁酸钠、200 mg/ kg 芽孢杆菌和500 mg/ kg 酶制剂后, 可增加肉鸡小肠肥大细胞、杯状细胞及上皮内淋巴细胞的数量, 但丁酸钠分别与芽孢杆菌和酶制剂混合饲喂, 效果在一定程度上好于单独饲喂丁酸钠。
